別誤殺了豬！非洲豬瘟熒光定量PCR檢測常見假陽性結(jié)果分析
發(fā)布時間：2021-08-29 瀏覽次數(shù)：5422次
指導(dǎo)策劃：仇華吉
支持媒體：豬易傳媒
非洲豬瘟疫情發(fā)生兩年多以來，養(yǎng)殖從業(yè)人員對于非洲豬瘟疫情的認(rèn)識從最初的漠不關(guān)心，到談非色變，如今多數(shù)豬場已經(jīng)找到了防控非洲豬瘟的辦法，發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟可防可控，并不可怕。目前，養(yǎng)豬業(yè)通過精準(zhǔn)檢測發(fā)現(xiàn)病原，同時有效執(zhí)行生物安全措施使得非洲豬瘟防控取得了可喜的進展，可有效遏制疫情發(fā)生和蔓延。
非洲豬瘟在我國暴發(fā)之初，養(yǎng)殖從業(yè)人員對于生物安全管理存在畏難心理，對非洲豬瘟病毒了解不夠，普遍認(rèn)為生物安全太難，無法有效執(zhí)行。發(fā)生非洲豬瘟后，精準(zhǔn)清除執(zhí)行不到位，以至于幾乎全軍覆沒，損失慘重。從今年很多豬場的經(jīng)驗來看，生物安全真正落實到位是可行且行之有效的。另外，選擇敏感、穩(wěn)定、性能優(yōu)異的檢測方法，結(jié)合有效的阻斷措施后，精準(zhǔn)清除的成功率非常高。
從筆者走訪的豬場所了解的一些案例來看，精準(zhǔn)清除失敗主要存在兩大原因：生物安全措施執(zhí)行不到位；檢測系統(tǒng)不科學(xué)。
非洲豬瘟診斷目前最有效、使用最多的方法是熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR檢測系統(tǒng)由熒光定量PCR儀、熒光定量PCR檢測試劑和耗材、核酸提取儀、核酸提取試劑和耗材等組成。設(shè)備、試劑和耗材選擇和搭配不當(dāng)，可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。
熒光定量PCR是一種非常敏感的檢測方法。實驗室經(jīng)常開展檢測工作，一旦實驗室管理和環(huán)境控制沒有執(zhí)行到位，就存在由于交叉污染出導(dǎo)致假陽性的風(fēng)險，進而帶來臨床上誤殺豬只的嚴(yán)重后果。下面，分析了一些常見的熒光定量PCR實驗室假陽性情況供大家參考。
一
熒光定量PCR檢測出現(xiàn)假陽性的常見原因
1. 實驗室污染是導(dǎo)致假陽性結(jié)果的主要原因
非洲豬瘟野毒感染時血液和組織中病毒載量非常高，經(jīng)常檢測到Ct值15左右的樣本。樣本處理和提取的過程中需要進行離心操作，這些高濃度的樣本離心時容易造成氣溶膠污染。對于血液和組織樣本，檢測非洲豬瘟病毒應(yīng)該盡可能減少離心操作，這類樣本病毒載量高、樣本較純凈，可以采用免提取檢測。
實驗室如果長期檢測陽性樣本，擴增產(chǎn)物中高濃度的目的片段很容易擴散到空氣中并不斷累積導(dǎo)致氣溶膠污染。
核酸自動提取儀可顯著提高實驗效率，然而，養(yǎng)殖企業(yè)實驗室大多使用中小型核酸自動提取儀，并且沒有適當(dāng)?shù)姆牢廴敬胧跇颖咎幚磉^程中可能出現(xiàn)交叉污染。相對于氣溶膠污染，樣本處理過程中交叉污染導(dǎo)致的假陽性概率較小。
2. 熒光定量PCR試劑盒污染或者非特異性反應(yīng)
某些試劑盒沒有在GMP車間進行生產(chǎn)，或者GMP車間生產(chǎn)過程中車間潔凈度不夠或人員操作不規(guī)范，在試劑盒生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)陽性核酸片段或者質(zhì)粒污染反應(yīng)體系的情況。
某些試劑盒生產(chǎn)工藝不過關(guān)，可能出現(xiàn)非特異性翹尾現(xiàn)象。
試劑盒中引物、探針等原料品質(zhì)不過關(guān)，質(zhì)量控制不嚴(yán)格，也可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。
3. 熒光定量PCR儀性能不佳導(dǎo)致翹尾
筆者發(fā)現(xiàn)某些熒光定量PCR儀性能不佳，在反應(yīng)后期出現(xiàn)非特異性翹尾峰。
4. 電壓不穩(wěn)導(dǎo)致的基線不穩(wěn)定
很多養(yǎng)殖企業(yè)將實驗室設(shè)置在豬場附近，使用電源大多是農(nóng)用電，電壓不穩(wěn)定，會導(dǎo)致擴增基線不穩(wěn)定。另外，豬場附近的臨床實驗室停電風(fēng)險相對較高。建議這些實驗室配備UPS緊急電源。
5. 樣本或者氣泡干擾
反應(yīng)體系中存在氣泡或者某些樣本含有特殊成分可能干擾實驗，產(chǎn)生非特異性擴增曲線，這種擴增曲線通常不呈現(xiàn)典型的S型擴增曲線形態(tài)。
二如何降低實驗室污染和假陽性？
實驗室質(zhì)量管理的關(guān)鍵要素通常離不開人、機、料、法、環(huán)，保證實驗室質(zhì)量，減少實驗室污染也離不開這幾個要素。
1. 加強人員培訓(xùn)，養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣，建立有效的溝通和激勵制度
實驗室質(zhì)量管理最核心的要素是人，必須培養(yǎng)良好的實驗操作和衛(wèi)生習(xí)慣；
熒光定量PCR實驗室分試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、核酸擴增區(qū)，嚴(yán)格分區(qū)管理；
不同區(qū)域的移液器用不同的標(biāo)識區(qū)分，防止混用；
不同區(qū)域使用不同顏色的實驗服區(qū)分，防止混穿；
不同區(qū)域的耗材、垃圾桶、銳器盒、抹布、拖把不混用；
實驗完成后使用84消毒液擦拭地面、臺面及移液器等；
實驗完成后使用紫外消毒車0.5m左右照射臺面30min；
嚴(yán)禁在實驗室打開擴增后的熒光定量PCR管，嚴(yán)禁在實驗室區(qū)域?qū)U增后的熒光定量PCR產(chǎn)物進行高壓滅菌或者加熱處理。
2. 選擇性能良好的核酸提取儀和熒光定量PCR儀
大型的全自動化核酸提取儀設(shè)計時會引入分區(qū)設(shè)計、紫外防污染、層流防污染等措施，在選購核酸自動提取儀時應(yīng)該考慮儀器的防污染性能。可以通過陰陽性樣本交叉擺放，同時提取最大檢測量的樣本，來評估核酸提取儀的防污染性能。
關(guān)于熒光定量PCR儀的選擇，某些儀器熱蓋設(shè)計存在嚴(yán)重缺陷，擴增結(jié)束后液體揮發(fā)嚴(yán)重，大量擴增產(chǎn)物泄漏，這種熒光定量PCR儀極易導(dǎo)致氣溶膠污染。
3．選擇帶UNG酶防污染體系和內(nèi)參的熒光定量PCR試劑盒
科學(xué)的試劑盒會引入UNG酶防污染體系，同時通過產(chǎn)品設(shè)計，保證PCR擴增效率。在降低氣溶膠污染同時，保證檢測的敏感性。
在熒光定量PCR擴增原料中不加TTP，只加UTP，擴增產(chǎn)物是含有UTP的核酸片段。UNG酶可以水解含有UTP的核酸片段，在擴增程序前添加UNG酶反應(yīng)程序，可水解反應(yīng)體系中含UTP的擴增產(chǎn)物，然后使用95℃高溫滅活UNG酶，再運行熒光定量PCR反應(yīng)程序，可以大幅度降低擴增產(chǎn)物氣溶膠污染。
某些試劑盒附帶的陽性對照濃度非常高（Ct值
使用帶內(nèi)參的熒光定量PCR試劑盒監(jiān)控每個反應(yīng)是否正常；使用弱陽性的樣本（27
4. 熒光定量PCR應(yīng)和普通PCR進行分區(qū)管理
某些檢測中心針對相同的傳染病檢測，可能既開展熒光定量PCR檢測，又開展普通PCR檢測。如果普通PCR的擴增片段覆蓋熒光定量PCR反應(yīng)的擴增片段，則普通PCR的擴增產(chǎn)物極易污染熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。
5. 規(guī)范設(shè)計，改善PCR實驗室環(huán)境
標(biāo)準(zhǔn)PCR實驗室通常分為四個區(qū)（熒光定量PCR實驗室無需產(chǎn)物分析區(qū)，分三個區(qū)），不同區(qū)域執(zhí)行不同的實驗操作（表1），中間品通過雙扉傳遞窗單向傳遞。不同區(qū)域之間空氣互相不流通，使用空調(diào)凈化系統(tǒng)控制不同區(qū)域氣壓，形成壓差，控制空氣流向。每個區(qū)域設(shè)置緩沖間，緩沖間外部設(shè)置PCR實驗室專用走廊（圖1）。
表1 PCR實驗室不同區(qū)域劃分及功能特點
圖1 PCR實驗室平面布局示意圖
注：四個獨立工作區(qū)，從試劑配制區(qū)到產(chǎn)物分析區(qū)空氣壓力逐步降低；試劑配制區(qū)和樣本處理區(qū)是正壓室，外開門設(shè)計，保證外面的空氣不進入；核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)是負(fù)壓室，內(nèi)開門設(shè)計，防止里面的空氣溢出。
目前很多集團公司中心實驗室裝修設(shè)計越來越規(guī)范，但是區(qū)域?qū)嶒炇液团R床實驗室大多條件相對簡陋，很難達到標(biāo)準(zhǔn)實驗室要求。建議基層實驗室在布局時，盡可能分三個房間設(shè)置不同功能區(qū)，如果做不到空氣凈化和壓差控制，則每個房間應(yīng)安裝排氣扇，及時通風(fēng)。
專家點評
點評專家：王長年
非洲豬瘟背景下，豬場的生物安全風(fēng)險(包括豬場人員流動、物品流動和豬只流動等)的監(jiān)測評估、精準(zhǔn)清除、引種(包括引入種豬和/或引入公豬精液等)都離不開實驗室的檢測，尤其是PCR實驗室的檢測。精準(zhǔn)檢測也逐漸成為各養(yǎng)豬企業(yè)的核心競爭力之一。
PCR實驗室在檢測非洲豬瘟病毒核酸的過程中常見一些假陽性結(jié)果， 而這些錯誤的信息又會給豬場相關(guān)管理人員帶來極大的心理和工作壓力。本文作者就非洲豬瘟PCR檢測過程中經(jīng)常出現(xiàn)的假陽性結(jié)果的主因(如樣本的采集、運輸、保存和處理、陽性對照、試劑盒生產(chǎn)廠家、與之配套的儀器設(shè)備等)進行分析，對如何減少和避免假陽性結(jié)果發(fā)生(如人員培訓(xùn)、儀器配套、內(nèi)參設(shè)置等)以及在實驗室建設(shè)方面進行科學(xué)、合理、規(guī)范化的設(shè)計(如分區(qū)設(shè)置、通風(fēng)處理)等多方面內(nèi)容進行介紹，非常適合廣大基層PCR實驗室作為參考。
編輯：河北方田 馮亞敏 審閱：仇華吉
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